U937人组织细胞淋巴瘤细胞（通过str）

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

慢冻程序

1.  标准程序：采用细胞冻存器

当温度在-25 ℃以上时，  1~2 ℃/min；

当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min；

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。

2.  简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。

3.  传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽长期储存。

细胞计数及存活测试

原理：

(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10 -4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

(3)存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

材料：

0.4%w/v trypan blue；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

步骤：

(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注：

4大格细胞总数×稀释倍数×10 4/4=细胞数/ml

每一大格的体积

=2.5px×2.5px×0.25px=10 -4ml

计数板计数时，适浓度为5～10×10 5细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

注意要点：

1、冷冻越慢越好，复苏越快越好。

2、与液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时，水浴中摇动小瓶易爆炸。且DMSO为有毒致癌品，接触时带好手套。

3、冻存细胞数量要足够，一般低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。

4、做好标记：培养瓶上应该用马克笔做好标记，写上细胞名称、代数和冻存时间。

5、对刚复苏的细胞动作要轻柔，避免细胞破裂。

6、DMSO对大多数细胞不敏感，所以解冻之后不需要除去DMSO，解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。

7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清，突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良，甚至死亡。