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原代细胞分离和培养技术

  • 发布日期:2020-11-30      浏览次数:206
    • 原代细胞分离和培养技术

      原代培养的原理

      将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶/胶原酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。主要包括取材——分离——培养等3部分;

      在原代细胞应用较多的包括:组织器官(如实体瘤、皮肤等)、悬浮细胞的取材等。

      下面依次介绍:

      一、肿瘤组织的取材

      病人自体的原代肿瘤细胞由于更接近临床患者标本,可以更好实现精ZHun医疗的肿瘤诊治模式,实现个体化精ZHun用药的目的。所以对病人自体肿瘤细胞体外分离与培养十分必要。

      具体步骤如下:

      1. 在无菌条件下的冰上对新鲜离体的肿瘤组织,剔除包膜及坏死组织,无菌PBS清洗3-5次;切成约1mm3组织块;

      2. 加入2mmol 的 EDTA,摇匀后放置冰上约 30-60min;

      3. 离心,并加入胶原酶消化(含蛋白酶);

      4. 消化期间,置于37°培养箱。每15min摇晃一次,消化时间根据肿瘤组织来定,约1-2h;

      5. 待大部分组织块消化成透明状时,用 40μm 的细胞滤网过滤细胞,收集;

      6. 用培养基重悬,置于培养箱培养。

      常见问题解答:

      Q:为什么我取得原代肿瘤组织,分离的却不是肿瘤细胞?

      A:取材时,我们要熟悉所需组织的类型和部位特征,选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。

      Q:若是细胞中混成纤维细胞,如何去除?

      A:成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快,可利用反复贴壁法使二者分离,进而达到清除成纤维细胞的目的。

      Q:为什么离心后,没有细胞分离出来?

      A:需要考虑消化酶的因素,由于肿瘤组织较致密,胰酶无法消化,一般选用胶原酶,如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法,如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别:

       

      胶原酶

      胰酶

      来源

      细菌

      胰脏

      消化组织

      纤维多的硬组织

      软组织

      对细胞影响

      伤害小

      长时间有损伤

      作用力度

      缓和

      Q:消化时间如何确定?

      A:具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。

      Q:消化之前为什么用EDTA?

      A:EDTA是一种非酶消化物,又称螯合剂,对一些组织,尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后,形成的机械力可使细胞分散。

      Q:细胞量太少,长不起来怎么办?

      A:有几种办法,如对没消化完的组织块反复消化,尽量多收集一些细胞;并且尽量传代到小皿里,如6孔板都可以。若是细胞仍太少,应耐心等待,尽量不要传代,只换液。

      Q:细胞难以贴壁?

      A:尽快使接种的细胞贴壁,是决定培养能否成功的关键。为了尽快促进细胞贴壁,可以提前1h将千分之的明胶铺于培养板。

      Q:肿瘤原代细胞培养方法与细胞系不同之处在哪里?

      A:培养基一般选用RPM1640,DMEM等,建议Hao能加入促生长的物质:如胰岛素、氢化可De松、雌激素、EGF等因子。

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