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支原体检测方法概述

  • 发布日期:2020-07-03      浏览次数:295
    • 支原体检测方法概述

      支原体污染严重干扰细胞实验结果,检测有无支原体污染的方法较多,可以根据自身实验室条件、检测方法便捷性等作出选择。

      电子显微镜或相差显微境观察。用扫描电镜或透射电镜,直观观察支原体形态。或者在细胞培养瓶内预置盖玻片,接种细胞在盖玻片上,培养24小时后取出用油镜观察。如有支原体,因支原体与细胞在不同平面,可发现支原体呈现暗色颗粒装。缺点:设备要求严格,检测成本高,不适合普通实验室日常常规检测。

      DNA荧光染色法,利用支原体没有细胞膜(壁)的特性,用荧光染料Hoechst 33258染色, Hoechst 33258能与支原体DNA结合着色,在荧光显微镜下观察,呈现绿色小点。缺点:灵敏度太低,当检测成阳性时,细胞经常已经严重污染。

      固体培养法,用支原体培养基大量增殖支原体,是相对可靠的支原体检测技术。缺点:耗时长,需要数周时间才能得到结果,不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外,该方法不能检测猪鼻支原体,因为猪鼻支原体不能在固体培养基上形成可见的菌落,猪鼻支原体(M.Hyorhinis)约占所有支原体污染的20-50%

      PCR法,提取细胞培养液,提取支原体,制备样品,根据支原体高度保守的16SrRNA序列设计引物(避免真核细胞或细菌DNA干扰),设置阴性,阳性对照,扩增产物经电泳后成像观察,可识别已发现的几乎全部100余种支原体。

      Quick Cell快速检测法,拓扑酶环化支原体DNA,在根据高保守区设计的引物引导下,采用特殊等温DNA扩增酶,61℃条件下,连续滚环式扩增支原体DNA 60分钟,根据有无支原体污染,随着扩增进程可目视实验结果。

      化学发光法,裂解支原体后,有底物情况下,支原体特异性的酶,能将ADP转化成ATPATP参与荧光素酶(Luciferase)催化底物荧光素(Luciferin)产生光的过程,所以可以通过催化底物荧光素导致的生物发光(Bioluminescence)信号来判别支原体DNA存在与否。

      综上所述,在多种支原体检测方法中,受实验条件、实验时长、便捷性等因素限制,-仅在很少情况下得到应用。实际科研工作中,应用Z为广泛的是 PCR支原体检测法;Quick Cell快速支原体检测法;化学发光支原体检测法。

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