TF-1人血液白血病细胞（通过str）

细胞冻存和复苏实验

一般来说，细胞进行转移和保存，*的策略是进行低温保存（-70℃~-196℃），而细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于*停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

经过前人的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻速融，这样可以大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

材料准备

1.  仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2.  玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、 培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。

3.  塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。

4.  其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5.  试剂：D-Hanks液、胎牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

细胞冻存

1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。

2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。

3、离心1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml。

5、 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

6、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞复苏

1.  从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.  从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

3.  离心， 1000 rpm，5 min。

4.  弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

5.  次日更换一次培养液，继续培养。